El 7 de agosto del 2017 se publicó en “Nature Nanotechnology” un estudio de Medicina bajo el título “Topical tissue nano-transfection mediates non-viral stroma reprogramming and rescue”. Desde mi punto de vista, este ha sido el descubrimiento más importante que he tenido la suerte de presenciar hasta el momento.

Veamos que nos cuenta este curioso estudio realizado por Chandan K. Sen et al.

La tecnología que Sen y su equipo utilizaron es la llamada Nanotransferencia de Tejidos (TNT) por sus siglas en inglés. Con esta tecnología usada en la Medicina Regenerativa, se pretendió desarrollar una “estrategia no viral fácil de implementar de reprogramación de tejidos locales a través de un dispositivo nanocanalizado validado con modelos de reprogramación nuevos y sólidamente establecidos de neuronas y endotelio inducido.”

Para este equipo de investigadores, se ha dado con una tecnología que juega con ventaja respecto a otros métodos, tales como el aislamiento (introducción de una célula de un microorganismo en un medio, sólido o líquido, esterilizado previamente) o la pluripotencia inducida (técnica de creación de células madre pluripotentes [iPS] a partir de células de nuestros tejidos sin usar embriones). Todo ello ha sido posible por los avances en reprogramación nuclear in vivo.

Arriba, células madre pluripotentes inducidas a partir de las células de la piel. Imagen: Laboratorio de Kathrin Plath, University of California, Los Angeles.

Arriba, Shinya Yamanaka, uno de los descubridores de las células iPS. Merecedor del Premio Nobel del Fisiología del 2012 junto con John Gurdon.

Como ya hemos dicho, este descubrimiento se apoyó en la tecnología TNT. Esta nos permitirá repartir factores reprogramantes dentro de las células por el citosol mediante un campo eléctrico intenso y enfocado a través de nanocanales ordenados. [Figura 1a].

Diagrama que nos muestra el proceso de la tecnología TNT en donde el electrón positivo se inserta intradérmicamente y el electrón negativo se une a la solución cargada. Entonces, se aplica un campo eléctrico de 250V para nanoperforar la membrana celular e inyectar la carga en el citosol.

Los nanocanales están en contacto con la parte más externa de la membrana celular.

¿TNT o BEP? Pues la respuesta es clara, TNT.

1.- Según la Figura 1c, se demostró que la tecnología TNT producía una perforación ordenada, mientras que BEP (tissue bulk electroporation) producía una poración desordenada. Lo podéis ver aquí:

Perfil de poración con diferentes células en donde aquellas tratadas con TNT están representadas con líneas continuas y aquellas tratadas con BEP están representadas con líneas discontinuas.

2.- Según la Figura 1d, se demostró que el uso de TNT estimulaba la presencia de AMB (Activated Bone Marrow o médula ósea activada) como se puede apreciar en el gráfico:

Resultados de la expresión de la expresión de AMB para TNT versus para BEP 24 horas después de la transfección (proceso que consiste en introducir material genético externo a células eucariotas mediante plásmidos u otros). BEP fue llevada a cabo vía inyección intradermal de los plásmidos de AMB seguido de un pulso de campo eléctrico.

3.- BEP está en desventaja porque es una tecnología de transfección usual la cual hace que el reparto de genes tenga una naturaleza altamente fortuita lo que podría suponer la activación de la respuesta inflamatoria (imagen) e incluso la muerte celular. Por otra parte, si atendemos a TNT, nos encontraremos con que reparte los factores reprogramantes de forma más enfocada y abundante a nivel de 1 sola célula.

4.- Otro de los descubrimientos fue que, gracias a experimentos con FAM (fluorescein amitide) se corroboró que TNT puede repartir la carga genética en menos de 1 segundo y de forma no invasiva según indican las Figuras 1e y 1f.

IVIS (Sistema de escaneo in vivo) [Figura 1e] y imágenes de microscopía confocal (microscopía que aumenta la resolución óptica y el contraste de un micrógrafo) [Figura 1f] de piel de ratón después de un tratamiento con TNT y ADN marcado junto con los factores ABM, respectivamente.

GFP es el “reporter gene” (en Biología Molecular, recibe este nombre el gen que busca fijarse en una secuencia reguladora de otro gen de interés de bacterias, animales o plantas) en el plásmido Ascl1.

5.- Sen y su equipo descubrieron que la TNT puede producir una respuesta ordenada que produzca aún más estímulos reprogramantes, más allá de la epidermis como verificaron con las figuras 1g, 1h i 1i:

En esta gráfica se ven los resultados de la expresión genética de qRT-PCR en la epidermis y la dermis y se demuestra que la expresión de los genes pasó más allá del límite de transfección epidérmica.

En este diagrama podemos ver el proceso de la propagación transfeccional mediada por EVs (vesículas extracelulares) desde la epidermis a la dermis.

Análisis de qRT-PCR de la carga de EVs donde se muestran cargas significantes de ABM cADNs/mARNs.

6.- Exponiendo naive cells (células que se han diferenciado en la matriz ósea) a EVs con AMB aisladas de la piel y tratadas con TNT se podía conseguir que las EVs fueran absorbidas por células remotas y propagar la reprogramación. También se produjo una reprogramación en las células de la piel. [Figuras 1j, 1k, 1l, 1m y 1n].

Diseño experimental para confirmar si las EVs son un medio viable para que se lleve a cabo la transfección y la reprogramación.  

Con esta miografía confocal vemos el fibroblasto embriónico de un ratón (rojo) que ha absorbido las EVs a las que les habían puesto ABM.

Tejido de fibroblastos embriónicos de ratón en el que se muestran las iNs (neuronas inducidas) el 7º día después de haber sido expuestas a 24 horas de EVs con ABM.

     Resultados que muestran el incremento de la expresión Tuj1 (m) y el incremento de neurofilamentos (NF) (n) en la piel después de una transfección de ABM.

7.- Ahora viene lo bueno. Con la Nanotransferencia de Tejidos (TNT) se consiguió obtener excitabilidad neuronal tal y como muestra la Figura 1o:

La actividad electrofisiológica está mostrada con barras representativas e indica cambios en la concentración iónica de la matriz extracelular. Esto es el resultado de la estimulación de un grupo de neuronas.

NT: La línea discontinua es el “ruido experimental”, NT 2: Cada barra representa el resultado de cada uno de los ratones.

Tras haber descubierto los 7 puntos anteriores y haber probado su éxito se lanzaron a desarrollar una metodología no-viral que pudiera reprogramar células de la piel en células endoteliales inducidas (iEC). Identificaron estos factores reprogramantes:

• Etv2
• Foxc2
• Fli1 (EFF)

NT: EFF podía reprogramar fibroblastos primarios humanos y de ratones en iECs de forma rápida (<1 semana) y eficiente.

Una vez hecho esto en el panorama in vitro, lo hicieron el el panorama in vivo.

8.- EFF con TNT conllevó a un aumento en la vascularización (angiogénesis [creación de vasos sanguíneos nuevos a partir de otros ya existentes]) y el rescate de tejido de la piel bajo condiciones de isquemia (estrés celular causado por una disminución aguda o crónica del riego sanguíneo. Puede causar muerte celular). [Figura 2a, 2b y 2c].

Con un tratamiento de una sola sesión y unos pocos segundos de duración se consiguió un aumento de la angiogénesis (Pecam-1, vWF) del tejido de la piel.

9.- El reparto de EFF basado en TNT estimula el flujo sanguíneo en el área tratada en solo 3 días como se puede comprobar, sobre todo, en las imágenes de la Figura 2d. [Figura 2d, 2e y 2f].

Imágenes con HRLS que muestran que se estimula la perfusión (flujo sanguíneo) en el área tratada con EFF a lo largo del tiempo.

Este escáner de ultrasonido de la piel tratada con EFF confirmó la presencia de vasos sanguíneos (@3mm de la superficie) con comportamiento pulsátil, lo que sugiere un éxito de la anastómosis (término que describe la unión de 2 elementos anatómicos con otros del mismo animal, en este caso) con el sistema circulatorio matriz.

10.- Una vez hecho esto, estudiaron si la reprogramación de la piel local con EFF tratada con TNT podía llevar a una reperfusión de tejidos isquémicos. Estos fueron los resultados: [Figura 2g,  2h y 2i].

Experimento con un colgajo de piel que muestra el incremento de la necrosis del colgajo en el grupo de control en comparación con la piel tratada con EFF.

Escaneo que muestra el incremento del flujo sanguíneo en el tejido implantado tratado con EFF mediante TNT.

Gráfico que recoge la cuantificación de la necrosis del pellejo de piel.

11.- Finalmente, querían demostrar si el reparto de EFF basado en TNT podía regenerar una articulación completa. Esto fue lo que obtuvieron: [Figura 3a, 3b, 3c, 3d, 3e y 3f]

Un tratamiento de una sola sesión de unos pocos segundos de duración llevó al incremento de la perfusión en la articulación seguido del corte transversal de la arteria femoral.

Las articulaciones de los ratones del grupo de control muestran una mayor necrosis de tejidos que las articulaciones tratadas con EFF.

Las medidas basadas en NMR de energéticas musculares confirmaron un incremento en los niveles de ATP y PCR para las articulaciones tratadas con EFF en comparación con el grupo de control.

Análisis por immunofluorescencia del músculo gastrocnemio que muestra una estimulación de la angiogénesis.

Como habéis podido comprobar, se trata de una tecnología y un descubrimiento realmente asombroso ya que va a arrojar mucha luz sobre una rama de la Medicina relativamente nueva y de la cual no se tienen muchos conocimientos todavía, la Medicina Regenerativa.

Sen y su equipo, cuando publicaron el estudio dijeron que en vistas a 1 año les gustaría probar esta tecnología con humanos.

Ya ha pasado 1 año casi desde aquel deseo, así que espero que puedan seguir investigando con TNT y de paso llevarse el Premio Nobel si triunfan con las investigaciones. Yo estaré aquí para informar.

OOO

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