19 mayo 2020

Tormenta de citosinas

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Resumen

La tormenta de citoquinas durante la infección viral es un predictor prospectivo de morbilidad y mortalidad, aunque las fuentes celulares permanecen indefinidas. Aquí, utilizando herramientas genéticas y químicas para sondear las funciones del receptor S1P 1 , dilucidamos los mecanismos celulares y de señalización que son importantes para iniciar la tormenta de citoquinas. Mientras que el receptor S1P 1 se expresa en células endoteliales y linfocitos dentro del tejido pulmonar, S1P 1El agonismo suprime las citocinas y el reclutamiento innato de células inmunes en ratones salvajes y deficientes en linfocitos, identificando las células endoteliales como reguladores centrales de la tormenta de citocinas. Además, nuestros datos revelan la infiltración de células inmunes y la producción de citocinas como eventos distintos que son orquestados por las células endoteliales. Además, demostramos que la supresión de las respuestas inmunitarias innatas tempranas a través de la señalización S1P 1 produce una reducción de la mortalidad durante la infección con una cepa patógena humana del virus de la gripe. La modulación del endotelio con un agonista específico sugiere que las enfermedades en las que la amplificación de la tormenta de citoquinas es un componente patológico significativo podrían ser químicamente tratables.

Gráficamente abstracto

Destacar

  • La señalización S1P1 inhibe las tormentas de citoquinas, respuestas inmunes potencialmente fatales
  • La señalización de S1P1 en el endotelio protege a los ratones de la influenza humana patógena.
  • En las tormentas de citoquinas, la producción de citocinas y el reclutamiento de leucocitos son eventos separados
  • La señalización S1P1 suprime la producción de quimiocinas por las células endoteliales pulmonares.

Introducción

La morbilidad y la mortalidad causadas por infecciones graves de influenza reflejan propiedades intrínsecas a la cepa del virus, incluido el potencial de replicación, el uso del receptor y los efectos citopáticos en las células epiteliales pulmonares (

) Además de los factores intrínsecos virales, los rasgos específicos del huésped, como las susceptibilidades divergentes a la infección, así como las diferencias en las respuestas inmunes del huésped, pueden mejorar o exacerbar tanto la infección como el resultado clínico. Una respuesta innata demasiado agresiva, con el reclutamiento temprano de leucocitos inflamatorios al pulmón, fue un contribuyente clave a la morbilidad de la infección por influenza de 1918 (

) La literatura clínica más reciente sobre la infección aviar por H5N1 documentó una asociación significativa entre las respuestas excesivas de citocinas tempranas, el reclutamiento de células inmunes y el mal resultado (

) Los enfoques de salud pública para las pandemias de influenza se han basado principalmente en estrategias de vacuna preventiva y medidas de apoyo, incluido el uso de terapias antivirales. Sin embargo, la velocidad a la que se propagó la pandemia porcina del virus de la influenza H1N1 2009 durante el retraso de la disponibilidad de vacunas puso de manifiesto la necesidad de identificar mecanismos adicionales para mejorar la infección por el virus de la influenza (

) Los medicamentos antivirales que inhiben la replicación del virus pueden seleccionar el escape mutacional, lo que hace que la terapia sea ineficaz. La modulación de la respuesta inmune del huésped tiene la ventaja potencial de ejercer una presión menos selectiva sobre las poblaciones virales. Aunque la perspectiva de una tormenta de citoquinas contundente es tentadora, una limitación importante para el tratamiento de enfermedades en las que la tormenta de citoquinas contribuye a la patogénesis es la comprensión limitada de los desencadenantes celulares de este proceso. Por lo tanto, buscamos definir vías de señalización celular que sean químicamente manejables para probar la hipótesis de que la modulación de la tormenta de citoquinas proporcionaría información sobre la patogénesis de la gripe, con posibles implicaciones terapéuticas.

Los moduladores químicos del sistema de señalización de esfingosina-1-fosfato (S1P) han proporcionado información sobre el tráfico de células inmunes y las respuestas inmunes (

) Debido a las propiedades inmunomoduladoras de la señalización del receptor S1P, los agonistas químicos se han utilizado con éxito para el tratamiento de la esclerosis múltiple recurrente y remitente (

) Aunque la biología de sistemas de los receptores S1P es compleja, con cinco subtipos de receptores, expresión diferencial, acoplamiento, atenuación y catabolismo (

), la disponibilidad de sondas químicas selectivas junto con modelos genéticos de ratones permite obtener información detallada sobre la inmunopatogénesis. Anteriormente demostramos que un agonista no selectivo del receptor S1P inhibía la tormenta de citoquinas, la migración de células dendríticas y la posterior proliferación de células T específicas de antígeno, protegiendo el tejido pulmonar de la lesión mediada por el huésped. El alivio de la inmunopatología por el agonista no selectivo del receptor S1P no afectó la eliminación del virus ni la producción de anticuerpos neutralizantes, lo que demuestra que, aunque la tormenta de citoquinas disminuyó, la retención de una respuesta inmune celular y humoral suficiente, así como la inmunidad protectora a largo plazo, aún ocurre (

)

Aquí, mediante el uso de un agonista selectivo de subtipo de receptor S1P 1 , así como herramientas genéticas y bioquímicas, definimos un ciclo de señalización endotelial crucial que es importante para el inicio de la tormenta de citoquinas. Revelamos que la secreción de citocinas y la infiltración de células inmunes son eventos separables que están regulados por el endotelio pulmonar. Además, demostramos que la supresión de las respuestas inmunitarias innatas tempranas a través de la señalización de S1P 1 da como resultado una reducción de la mortalidad durante el desafío del virus de la influenza patógena humana. Por lo tanto, la señalización del receptor S1P 1 en el endotelio proporciona un mecanismo para atenuar la morbilidad inducida por el virus de la influenza y revela un papel inesperado para las células endoteliales como reguladores de la tormenta de citoquinas.

Resultados

 Administración de un agonista S1P 1 embota la tormenta de citoquinas

Anteriormente, informamos que el tratamiento de ratones infectados con el virus de la influenza con AAL-R, un agonista del receptor S1P promiscuo para los receptores S1P 1 y S1P 3-5 , inhibe la expresión temprana de citocinas proinflamatorias y la acumulación innata de células inmunes dentro del pulmón (

) Para evaluar la contribución de la señalización del receptor S1P 1 en la inhibición de la inflamación temprana inducida por el virus de la influenza, los ratones infectados se trataron con el agonista específico del receptor S1P 1 CYM-5442 (

) El tratamiento con 2 mg / kg de CYM-5442 dos veces al día inhibió significativamente la secreción de citocinas y quimiocinas asociadas con la patología inducida por el virus de la influenza, incluidos IFN-α, CCL2, IL-6, TNF-α e IFN-γ ( Figura 1 A ) además de CCL3, CCL5, CXCL2 e IL-1α ( Figura S1 A), en comparación con ratones tratados con vehículo 48 horas después de la infección. La reducción CYM-5442 de la expresión de IFN-α, CCL2, CCL3, CCL5, IL-1α e IL-6 fue tan completa como el tratamiento con el agonista promiscuo; sin embargo, no fue tan efectivo como AAL-R en la supresión de CXCL2, TNF-α e IFN-γ ( Figura 1 A y Figura S1A), lo que sugiere un papel para otros receptores S1P en la modulación de esas citocinas. Además de inhibir la producción de citocinas / quimiocinas, la administración de AAL-R y CYM-5442 a ratones infectados con el virus de la gripe redujo la acumulación de infiltrado inflamatorio innato caracterizado como macrófagos / monocitos (CD11b + , F480 + , Ly6G  ), neutrófilos (CD11b + , LyG6 + , F480  ) y células NK (NK1.1 + , CD3  ), aunque AAL-R fue más eficaz para inhibir la acumulación de macrófagos / monocitos y células NK en el pulmón ( Figura 1SI). También observamos una reducción significativa de la expresión de CD69 en macrófagos / monocitos y células NK después del tratamiento con CYM-5442 o AAL-R 48 horas después de la infección, lo que demuestra una disminución de la activación celular ( Figuras 1 C y 1D). A pesar de la disminución significativa del reclutamiento de células inmunes innatas y las respuestas de citocinas / quimiocinas, no observamos diferencias en los títulos virales después del tratamiento con AAL-R o CYM-5442 en comparación con los ratones tratados con vehículo ( Figura S2 ), lo que demuestra que el agonismo S1P 1 no inhibe ni mejora replica viral. En conjunto, estos resultados revelan que la activación de un solo receptor de esfingosina-1-fosfato, S1P 1, es suficiente para mitigar la inflamación innata global después de la infección por el virus de la gripe adaptada al ratón en ratones.

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Figura 1 El agonismo del receptor S1P 1 suprime la producción temprana de citocinas y quimiocinas proinflamatorias y el reclutamiento de células inmunes innatas durante la infección por el virus de la influenza
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Figura S1 S1P 1 El agonismo suprimió múltiples citocinas / quimiocinas proinflamatorias después de la infección por el virus de la influenza, relacionadas con las  ,  ,  y 
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Figura S2 El tratamiento con AAL-R o CYM-5442 no alteró los títulos virales en el pulmón después de la infección por el virus de la influenza, relacionado con la 
A continuación, preguntamos si el agonismo del receptor S1P 1 podría suprimir las respuestas innatas tempranas de citocinas y quimiocinas después de la infección con un aislado humano patógeno del virus de la gripe. Para probar esto, infectamos a ratones con un aislado virulento del virus de la influenza pandémica H1N1 2009 que se aisló de un paciente hospitalizado y nunca se ha pasado a través de ratones (A / Wisconsin / WSLH34939 / 09) (

) La infección de ratones C57BL / 6J con esta cepa causa una enfermedad grave, lo que resulta en una mortalidad rápida que comienza entre los días 4 y 6 después de la infección (datos no mostrados). Similar a la infección con el virus de la gripe WSN adaptado al ratón, el tratamiento con CYM-5442 después de la infección con H1N1: 2009 suprimió significativamente las respuestas de citocinas y quimiocinas y la acumulación de células inmunes innatas activadas después de la infección 48 horas ( Figuras 2 A y 2B). También probamos un agonista selectivo del receptor S1P 1 adicional (RP-002) para proporcionar soporte para S1P 1especificidad del receptor y mostrar directamente que los agonistas selectivos de S1P1 comparten esta modulación de la inmunopatología innata. Infectamos ratones con el virus de la influenza pandémica H1N1: 2009 como se indicó anteriormente y tratamos a los ratones con RP-002 a las 1 y 25 horas después de la infección. Similar a lo que observamos con CYM-5442, el tratamiento con RP-002 inhibió significativamente la producción de múltiples citocinas y quimiocinas proinflamatorias ( Figura 2 C) y suprimió la acumulación de macrófagos / monocitos (CD69 + ) activados y células NK en el pulmón infectado 48 h postinfección ( Figura 2 D). Además, la supresión mediada por RP-002 del reclutamiento de células inmunes innatas y la producción de citocinas / quimiocinas se produjo sin alterar los títulos virales pulmonares ( Figura S3 ), lo que demuestra que S1P1 la supresión mediada por el agonista de citocinas y quimiocinas no se debe a los efectos directos sobre la replicación del virus influenza.

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Figura 2 El agonismo del receptor S1P 1 suprime la producción y el reclutamiento temprano de citocinas y quimiocinas proinflamatorias y el reclutamiento de células inmunes innatas activadas durante la infección por el virus de la influenza porcina H1N1: 2009 patógena humana
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Figura S3 El tratamiento RP-002 no altera los títulos virales en el pulmón después de la infección por el virus de la influenza patógena humana, en relación con la  y la 

 La supresión mediada por agonistas de S1P 1 de las respuestas inmunitarias innatas tempranas da como resultado la protección contra el desafío del virus de la influenza patógena humana en ratones

Las respuestas inmunes innatas desreguladas tempranas en el pulmón se han asociado con morbilidad y mortalidad durante la infección con cepas altamente patógenas del virus de la influenza (

) Por lo tanto, preguntamos si el embotamiento de las respuestas tempranas de citocinas / quimiocinas innatas utilizando un agonista S1P 1 podría proteger a los ratones de la infección letal con un aislado humano virulento de la pandemia H1N1 2009 que no se había pasado en ratones (A / Wisconsin / WSLH / 34939/09) . Para no imponer estrés adicional al pulmón infectado y debido a que el suministro oral es una ruta popular para la administración de fármacos, administramos por vía oral el agonista S1P 1 , RP-002, a 6 mg / kg por sonda a ratones C57BL / 6J infectados con 1 × 10 5 UFP de A / Wisconsin / WSLH / 34939/09 a las 1 y 25 horas después de la infección. RP-002 suprimió significativamente la amplificación de citoquinas ( Figura 3 A), así como el reclutamiento de células mieloides al pulmón infectado, medido por citometría de flujo (Figura 3 B).

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Figura 3 La administración oral de un agonista S1P 1 suprime la producción temprana de citocinas y quimiocinas innatas y mejora significativamente la supervivencia a la infección letal con el virus de la influenza porcina H1N1 2009
La administración temprana de RP-002 resultó en un mejor tiempo de supervivencia después de la exposición letal con A / Wisconsin / WSLH / 34939/09, con el inicio de la muerte en ratones tratados con vehículo el día 6 después de la infección en comparación con el día 11 después de la infección para ratones tratados con RP-002 ( Figura 3 C, p <0,005). Además, el tratamiento con RP-002 resultó en una mejora significativa en la supervivencia general en comparación con los ratones tratados con vehículo (20% de mortalidad en RP-002 versus 80% de mortalidad para vehículo, p <0,005; Figura 3 C). Estos hallazgos demuestran un fenotipo biológico significativo resultante de la S1P 1 temprana.tratamiento con agonista del receptor después de la infección por el virus de la influenza patógena. Al mostrar directamente que el aborto de un primer paso en la amplificación de citoquinas protege significativamente contra una infección patógena humana H1N1: 2009, normalmente mortal, los hallazgos amplían las observaciones previas de una asociación entre humanos y modelos animales en los que la desregulación de las respuestas inmunes innatas contribuye a la morbilidad y la mortalidad. Es importante destacar que el tratamiento con RP-002 mejoró la morbilidad y la mortalidad asociadas con la infección grave por influenza H1N1: 2009 patógena en humanos. Los efectos sobre la supervivencia están en consonancia con nuestros datos publicados anteriormente (

) que este mecanismo no altera la respuesta de anticuerpos neutralizantes específicos de virus, la maduración de afinidad y el cambio de clase. Esto documenta que la tormenta de citoquinas juega un papel directo y cardinal en la enfermedad pulmonar mediada por la gripe. Luego buscamos delinear el mecanismo de supresión de S1P1 de la amplificación de citoquinas.

 S1P 1 se expresa en endotelio pulmonar y linfocitos

Para identificar las células en el pulmón que expresan el receptor S1P 1 , utilizamos un ratón knockin receptor eGFP-S1P 1 en el que el receptor S1P 1 nativo se reemplazó de forma homóloga con un receptor S1P 1 marcado con proteína fluorescente verde funcional (eGFP) funcional (S1P) 1 -eGFP) (

) Este modelo de ratón permitió la detección directa de la expresión de la proteína del receptor eGFP-S1P 1 por citometría de flujo, con confirmación bioquímica adicional utilizando anticuerpos altamente específicos para GFP seguido de transferencia Western que distingue el receptor fusionado S1P 1 -eGFP por peso molecular específico. Se detectaron altos niveles de S1P 1 -eGFP en el endotelio linfático pulmonar (CD45  , CD31 + , gp38 + ) y vascular (CD45  , CD31 + , gp38  ), mientras que el epitelio pulmonar (CD45  , CD31  , EpCAM + ) fue negativo para S1P 1 -eGFP (Figura 4 A). Como se informó anteriormente, las células T CD4 + (CD4 + , CD3 + ), las células T CD8 + (CD4 + , CD3 + ) y las células B (B220 + , CD19 + ) expresaron S1P 1 -eGFP ( Figura 4 B), mientras que leucocitos, incluidos macrófagos / monocitos, un subconjunto de macrófagos alveolares (F480 + , CD11c + , CD11b  ), células dendríticas (CD11c + , I / AI / E + , CD205 + , F480  ), neutrófilos, células NK (NK1. 1 + , CD3 ), y las células linfoides innatas (Lin  Sca1 + ), expresaron niveles insignificantes de S1P 1 -eGFP ( Figura 4 C y datos no mostrados). Las células de ratones no infectados expresaron niveles similares de S1P 1 -eGFP que los ratones infectados, lo que demuestra que la expresión del receptor S1P 1 no se altera después de la infección por el virus de la influenza ( Figura 4 D). Para confirmar la S1P 1 patrón de expresión EGFP, un western blot para S1P 1 -EGFP se realizó en células FACS de los pulmones de ratones infectados y no infectados. Las células endoteliales, las células T y las células B fueron positivas para S1P 1-eGFP en ratones no infectados, confirmando nuestros resultados de citometría de flujo ( Figura S4 A). Sin embargo, aunque S1P 1 -eGFP fue detectado por Western Blot en células B de ratones no infectados, no detectamos la expresión de S1P 1 -eGFP por Western Blot en células B residentes en los pulmones infectadas con el virus de la influenza ( Figura S4 A). No detectamos la expresión de S1P1-eGFP por Western blot en células epiteliales, macrófagos / monocitos y macrófagos alveolares antes o después de la infección por el virus de la influenza ( Figura S4 A). Además, el tratamiento con CYM-5442 de ratones knockin S1P 1 -eGFP infectados no disminuyó la expresión de S1P 1-eGFP en células endoteliales, células T o células B, lo que demuestra que la administración de este agonista específico de S1P 1 no induce la degradación del receptor S1P 1 ( Figura S4 B). Por lo tanto, CYM-5442 no ejerce un efecto antagonista debido a la degradación del receptor, lo que demuestra el agonismo funcional de S1P 1 como el mecanismo por el cual CYM-5442 suprime la tormenta de citoquinas.

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Figura 4 El receptor S1P 1 se expresa en endotelio pulmonar y linfocitos, pero no en células epiteliales pulmonares
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Figura S4 El receptor S1P 1 se expresa en linfocitos pulmonares y células endoteliales, relacionado con la 

 La inhibición de la tormenta de citoquinas no se debe a la activación del receptor de linfocitos S1P 1

Los linfocitos y el endotelio pulmonar son las únicas células dentro del pulmón que expresan cantidades medibles de S1P 1 -eGFP detectadas por citometría de flujo y transferencia Western. Es plausible que los linfocitos dentro del pulmón proporcionen un efecto espectador durante la respuesta inmune innata a la infección por el virus de la influenza. Para descartar un papel para los linfocitos durante la inhibición de la inflamación mediada por el receptor S1P 1 después de la infección por el virus de la influenza, se infectaron ratones Rag2 – / – deficientes en linfocitos y se trataron con vehículo o CYM-5442. La administración de CYM-5442 a ratones Rag2 – / – infectados con el virus de la influenza resultó en una inhibición significativa de la expresión de IFN-α, CCL2, IL-6, TNF-α e IFN-γ ( Figura 5A), además de CCL5, CXCL2 y CXCL10 ( Figura S1 B). Las poblaciones de linfocitos atípicos que podrían, en principio, contribuir a la supresión de la producción de citocinas no expresaron S1P1-eGFP y, por lo tanto, tampoco contribuyen a este mecanismo. Los infiltrados de células inflamatorias, incluidos los macrófagos / monocitos y las células NK, se redujeron significativamente en ratones Rag2 – / – tratados con CYM -5442 ( Figura 5 B). También se observó un número reducido de neutrófilos dentro del pulmón infectado, pero la diferencia no fue estadísticamente significativa ( Figura 5 B). Además, los macrófagos infiltrantes de pulmón y las células NK en ratones Rag2 – / – se activaron menos, según lo medido por la expresión de superficie CD69 ( Figura S5) El tratamiento con CYM-5442 de ratones deficientes en linfocitos infectados con el virus de la influenza inhibe la respuesta inflamatoria innata, excluyendo el papel de los linfocitos como reguladores clave de la tormenta de citocinas inducida por el virus de la influenza.

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Figura 5 El agonismo del receptor S1P 1 suprime las respuestas inmunitarias proinflamatorias tempranas independientemente de los linfocitos
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Figura S5 El agonismo S1P 1 suprime la activación inmune innata de células después de la infección por influenza en ratones con deficiencia de linfocitos, en relación con la 

 El agonismo del receptor S1P 1 suprime el reclutamiento de células inmunes a través de la regulación negativa de la producción de quimiocinas por las células endoteliales pulmonares

La fuerte expresión del receptor S1P 1 -eGFP en el endotelio pulmonar, junto con la inhibición de la tormenta de citoquinas en ratones RAG2 – / – , sugiere que la señalización del receptor S1P 1 en las células endoteliales pulmonares suprime la tormenta de citoquinas. Se ha demostrado que las células endoteliales producen diversas citocinas y quimiocinas durante los procesos inflamatorios y pueden ser una fuente de citocinas y quimiocinas en el pulmón durante la infección por el virus de la gripe. Para evaluar los efectos del tratamiento con CYM-5442 sobre la producción de citocinas y quimiocinas de células endoteliales pulmonares, purificamos las poblaciones de células endoteliales pulmonares y realizamos análisis de ARNm y proteínas. Las células endoteliales expresaron niveles elevados de las quimiocinas CCL2, CCL5 y CXCL10 a nivel de ARNm ( Figura 6UNA ). Es importante destacar que el tratamiento con CYM-5442 redujo significativamente la expresión de ARNm de las quimiocinas en las células endoteliales del pulmón en comparación con los ratones tratados con vehículo temprano después de la infección por el virus de la influenza ( Figura 6 A). El examen de la producción de quimiocinas en células endoteliales pulmonares y vasculares pulmonares purificadas reveló una reducción significativa en la producción de quimiocinas a nivel de proteína después del tratamiento con CYM-5442 ( Figura 6 B). El análisis de la expresión de integrina de células endoteliales pulmonares no mostró diferencias apreciables en ratones infectados con el virus de la gripe tratados con vehículo en comparación con CYM-5442 ( Figura S6 ).

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Figura 6 El agonismo del receptor S1P 1 suprime activamente el reclutamiento de células inmunes innatas a través de la regulación negativa de la expresión de quimiocinas en las células endoteliales pulmonares
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Figura S6 El agonismo S1P 1 no altera los niveles de expresión de la molécula de adhesión en las células endoteliales pulmonares, en relación con la 
Debido a que la presentación de quimiocinas en las células endoteliales es crucial para la activación de los leucocitos y la extravasación en el tejido infectado, preguntamos si la reducción de la expresión de quimiocinas después del tratamiento con CYM-5442 resultó en una menor entrada de células inflamatorias en el pulmón infectado. Para estos experimentos, utilizamos ratones LysM-GFP en los que los macrófagos, monocitos y neutrófilos expresan proteínas fluorescentes verdes, lo que nos permite rastrear estas poblaciones celulares después de la transferencia adoptiva a ratones congénicos C57BL / 6J. Infectamos ratones LysM-GFP con virus de la gripe y 48 horas más tarde purificamos células de médula ósea para la transferencia adoptiva. 5 x 10 6 células de médula ósea LysM-GFP se transfirieron a infectados por virus de la gripe ratones C57BL / 6J se trataron con vehículo o CYM-5442 ( Figura 6C). Los pulmones de ratones C57BL / 6J infectados o no infectados que recibieron células LysM-GFP se recogieron 48 horas después de la infección, y se cuantificó el número de células positivas para GFP en el pulmón. El tratamiento con CYM-5442 resultó en un reclutamiento significativamente reducido de neutrófilos positivos para GFP (CD11b + F480  Ly6G + ) y macrófagos / monocitos (CD11b + Ly6G  F480 + ) en el pulmón ( Figura 6 D). Por lo tanto, el tratamiento con CYM-5442 inhibe la infiltración de células inflamatorias circulantes en el pulmón.
La señalización del receptor S1P 1 se asocia con una integridad capilar mejorada (

), por lo que los antagonistas del receptor S1P 1 inducen una fuga vascular (

), y los agonistas selectivos de S1PR protegen de la fuga vascular inducida por la administración exógena de VEGF (

) Aunque el reclutamiento mielomonocítico no está modulado por los cambios de permeabilidad endotelial, evaluamos formalmente si la supresión del reclutamiento de células inflamatorias al pulmón reflejaba una inhibición pasiva del reclutamiento de leucocitos o si la supresión de las quimiocinas en las células endoteliales del pulmón limita el reclutamiento innato de células inmunes. Se realizaron experimentos de rescate en los que los ratones se infectaron con influenza en presencia o ausencia de administración intratraqueal de CCL2 murino recombinante (rmCCL2), con o sin tratamiento con CYM-5442. La administración de rmCCL2 a ratones infectados tratados con CYM-5442 restableció los números de macrófagos / monocitos y células NK en el pulmón a niveles equivalentes a los ratones infectados tratados con vehículo ( Figura 6E) 48 horas después de la infección. Estos datos demuestran que la inhibición de CYM-5442 de la infiltración celular en el pulmón no se debe a la mejora de la función de barrera celular endotelial sino a la supresión de la producción de quimiocinas. Por lo tanto, el agonismo del receptor S1P 1 suprime la expresión de quimiocinas de células endoteliales, lo que da como resultado una infiltración celular disminuida. A pesar del rescate de los niveles de CCL2 en BALF y la restauración del reclutamiento de macrófagos / monocitos en el pulmón de ratones tratados con CYM-5442, la producción global de citocinas y quimiocinas no se restableció ( Figura 6 F y Figura S1 C). La infección por el virus de la influenza de ratones con deficiencia de CCR2 produce reducciones sustanciales de macrófagos / monocitos infiltrantes (

) Para descartar macrófagos infiltrantes, infectamos ratones deficientes en CCR2 con el virus de la gripe WSN como se hizo anteriormente y los tratamos con vehículo o CYM-5442. La infección de ratones con deficiencia de CCR2 resultó en un número significativamente reducido de macrófagos / monocitos sin alterar los números de neutrófilos o células NK en el pulmón después de la infección 48 horas ( Figura S7 A). A pesar de los niveles reducidos de macrófagos / monocitos en el pulmón, todavía detectamos niveles significativos de IFN-α, CCL2, CCL3, CCL5, CXCL2, CXCL10, IL-1α, IL-6 e IFN-γ ( Figura S7 B). Más importante aún, el tratamiento de ratones con deficiencia de CCR2 con CYM-5442 todavía redujo significativamente todas las citocinas y quimiocinas probadas a las 48 horas después de la infección, excepto CCL5 ( Figura S7SI). El fracaso para inhibir la producción de citocinas y quimiocinas en ratones con deficiencia de CCR2 o para restablecer la producción de citocinas y quimiocinas mediante la inducción de infiltración de células de macrófagos / monocitos a través de la administración de rmCCL2 después del tratamiento con CYM-5442 sugiere que los monocitos y los macrófagos no son las principales fuentes de citocinas tempranas y producción de quimiocinas. Además, estos datos indican que el reclutamiento celular y las respuestas de citoquinas pueden ser eventos desacoplados.

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Figura S7 La inhibición de macrófagos inflamatorios / reclutamiento de monocitos no altera las respuestas de citocinas / quimiocinas después de la infección por el virus de la influenza, en relación con la 

 Las respuestas a citocinas proinflamatorias son independientes del reclutamiento de células inmunes innatas y dependen de la señalización de interferón tipo I

La infiltración de macrófagos y células NK por sí sola no parece estar asociada con la tormenta de citoquinas. Por lo tanto, evaluamos la contribución de la infiltración celular inflamatoria total a la producción de citocinas durante la infección por el virus de la influenza. Los ratones fueron tratados con un anticuerpo anti-CD11b (M7 / 80) que se ha demostrado que inhibe el reclutamiento de células que expresan CD11b en tejidos inflamados (

) Aunque el tratamiento con anti-CD11b inhibió significativamente el reclutamiento de macrófagos / monocitos, neutrófilos y células NK en el pulmón ( Figura 7 A), no observamos reducción en los niveles de citocinas / quimiocinas proinflamatorias, aparte de IFN-γ ( Figura 7 B ), que probablemente sea un resultado directo de la disminución de la infiltración de las células NK, la fuente principal de IFN-γ en este momento. Además, el tratamiento con CYM-5442 inhibió significativamente la producción de IFN-α, CCL2, IL-6, TNF-α e IFN-γ ( Figura 7 B), además de CCL3, CCL5, CXCL2, CXCL10 e IL- 1α ( Figura S1D) en ratones tratados con anti-CD11b. Estos resultados demuestran además que el reclutamiento de células innatas y la producción de citocinas son eventos independientes tempranos después de la infección por el virus de la influenza, ambos inhibidos por el agonismo del receptor S1P 1 de las células endoteliales pulmonares. Es importante destacar que nuestros datos demuestran que la infiltración de células inflamatorias en el pulmón no es necesaria para la producción de citocinas y quimiocinas. Una línea de evidencia adicional que excluye las células hematopoyéticas de S1P 1La reducción mediada por el agonista de las respuestas de citocinas y quimiocinas innatas tempranas después de la infección por el virus de la gripe fue proporcionada por la resistencia a la irradiación de la supresión del agonista S1P1. Los ratones C57BL / 6J se irradiaron con 500 rads y 24 horas después se infectaron con el virus de la gripe WSN y se trataron con vehículo o CYM-5442. La irradiación redujo las células hematopoyéticas CD45 + en el pulmón en un 90% (vehículo: 2 × 10 7 células / pulmón versus 500 rads: 2 × 10 6células / pulmón), y lo que es más importante, el tratamiento de ratones irradiados con CYM-5542 redujo significativamente los niveles de IFN-α (vehículo irradiado: 86 pg / ml versus CYM-5442 irradiado: 17,9 pg / ml, p = 0,0006), CCL2 ( vehículo irradiado: 944 pg / ml versus CYM-5442 irradiado: 452 pg / ml, p = 0.00002), CXCL10 (vehículo irradiado: 204 pg / ml versus CYM-5442 irradiado: 83 pg / ml, p = 0.00003) e IL -6 (vehículo irradiado: 170 pg / ml versus CYM-5442 irradiado: 70 pg / ml, p = 0,0001), lo que demuestra que una población celular resistente a la radiación mediaba la supresión mediada por el receptor S1P 1 de la respuesta inflamatoria. Estos resultados, junto con el patrón restringido de expresión del receptor S1P 1 , respaldan un papel importante para las células endoteliales en la regulación de las respuestas inmunes pulmonares innatas al virus de la gripe.

Figura miniatura gr7
Figura 7 Las respuestas de citocinas proinflamatorias son independientes del reclutamiento de células inmunes innatas y dependen de la señalización de interferón tipo I
Los interferones tipo I, predominantemente especies de IFN-α, se elevan temprano después de la infección del virus respiratorio y se cree que son cruciales para la producción de citocinas y quimiocinas proinflamatorias. Nuestros resultados hasta ahora han demostrado que el tratamiento con CYM-5442 inhibe constantemente la producción de IFN-α en el pulmón temprano después de la infección por el virus de la influenza ( Figura 1 , Figura 2 , Figura 5 y Figura 6) Por lo tanto, postulamos que la disminución de la producción de IFN-α puede ser un mecanismo por el cual CYM-5442 inhibe la tormenta de citoquinas temprano después de la infección por el virus de la influenza. Para abordar esto, infectamos a los ratones inactivados con el receptor de IFNα / β con el virus de la gripe, tratamos a estos ratones con vehículo o CYM-5442, y medimos el reclutamiento de células innatas y la producción de citocinas / quimiocinas 48 horas después de la infección. No se observaron diferencias significativas en el reclutamiento de células inflamatorias de macrófagos / monocitos, neutrófilos y células NK en el pulmón de ratones con deficiencia de receptor IFNα / β en comparación con ratones C57Bl / 6J ( Figura 7 C). Como se vio con ratones C57BL / 6J infectados, el tratamiento con CYM-5442 inhibió el reclutamiento innato de células inmunes en ratones con deficiencia de receptores IFNα / β 48 horas después de la infección ( Figura 7C). A pesar del reclutamiento de células inmunes innatas en el pulmón de ratones con deficiencia de receptor de IFNα / β 48 horas después de la infección, estos ratones exhibieron niveles significativamente reducidos de IFN-α, CCL2, IL-6 e IFN-γ ( Figura 7 D) además de CCL5 y CXCL10 en el fluido BALF ( Figura S1 E). Tomados en conjunto, nuestros datos demuestran que la regulación del reclutamiento celular en el tejido pulmonar está mediada por células endoteliales y es independiente de la señalización de interferón tipo I. Además, el agonismo del receptor S1P 1 de las células endoteliales inhibe la producción de IFN-α y da como resultado la amortiguación de las respuestas globales de citocinas proinflamatorias.

Discusión

El reclutamiento de células inmunes innatas en los pulmones combinado con la producción excesiva de citocinas proinflamatorias y quimiocinas son características de la infección por el virus de la influenza (

) Contrariamente al dogma actual, que coloca el epitelio pulmonar y el infiltrado inflamatorio en el centro de la tormenta de citocinas inducida por el virus de la influenza (

), demostramos aquí un papel central para el endotelio pulmonar en la regulación de este proceso. Además, determinamos que tanto el reclutamiento innato de células inmunes como la producción temprana de citocinas y quimiocinas innatas son eventos desacoplados, con células endoteliales en el centro de ambos procesos. Los enfoques químicos y genéticos que se muestran aquí tienen un impacto potencialmente amplio en la comprensión de la patogénesis de la enfermedad. La desregulación temprana de las respuestas celulares y de citoquinas innatas predice la gravedad de la enfermedad y la muerte durante la infección por virus de la influenza altamente patógena

) La inducción temprana de las citocinas IFN-α, TNF-α, IL-1α e IL-6 y las quimiocinas CCL2, CCL3, CXCL2 (IL-8) y CXCL10 están asociadas con la formación de síntomas en humanos (

) TNF-α, IL-1 e IL-6 poseen actividades multifuncionales y están asociadas con la morbilidad durante la infección por el virus de la influenza. Las quimiocinas como CCL2, CCL3, CXCL2 y CXCL10 inducen el reclutamiento de células inmunes innatas en el pulmón, lo que puede liberar más citocinas que exacerban la tormenta de citoquinas y dañar aún más el pulmón. Demostramos que la supresión de las respuestas inmunitarias innatas tempranas a través de la señalización de S1P 1 en las células endoteliales da como resultado una mortalidad significativamente reducida durante la infección de ratones con una cepa patógena humana del virus de la influenza ( Figura 3 ). Es importante destacar que nuestros resultados identifican un tipo de célula pulmonar, las células endoteliales, como objetivos potenciales para suprimir las respuestas inflamatorias innatas excesivas.

La capacidad del CYM-5442 para disminuir la producción de IFN-α temprano después de la infección por el virus de la influenza es ampliamente relevante. El requisito de la señalización de interferón tipo I para la producción temprana de múltiples citocinas y quimiocinas después de la infección por el virus de la influenza es sorprendente. Además, la producción de citocinas proinflamatorias requiere señalización de interferón tipo I, pero la vía de interferón tipo I es prescindible para el reclutamiento celular. Aunque se sabe que la señalización de interferón tipo I inhibe la replicación viral (

), la evidencia también apunta a los roles patogénicos para IFN-α durante la infección viral. Varias citocinas y quimiocinas proinflamatorias están aguas abajo de la señalización del receptor de interferón tipo I. Además, el inicio de la enfermedad se correlaciona directamente con la producción respiratoria local de IFN-α en humanos (

) Por lo tanto, la señalización de interferón tipo I puede desempeñar un doble papel en la patogénesis viral y la eliminación viral. La señalización del receptor S1P 1 en células endoteliales pulmonares romos in vivo pero no elimina la producción de IFN-α y puede explicar por qué la patología se reduce sin comprometer la capacidad del huésped para eliminar el virus.

La capacidad de activación del receptor S1P 1 para suprimir la producción de citocinas y quimiocinas en el pulmón en ratones irradiados, junto con el patrón de expresión del receptor S1P 1 en el pulmón, indica fuertemente un componente endotelial central para las respuestas inmunes innatas tempranas. Una pregunta interesante es si las poblaciones de células endoteliales, linfáticas, vasculares o pulmonares son directamente responsables de la modulación inmune observada. Además, de la gran reserva de receptores en la sangre, el endotelio asegura que la expresión del receptor S1P 1 se mantenga en las superficies basolateral y luminal de las poblaciones de células endoteliales objetivo (

) y conserva la capacidad de respuesta al agonista. Todavía se necesitan enfoques adicionales para separar las contribuciones sanguíneas y linfáticas. Aunque sabemos que las células endoteliales producen quimiocinas, aún debe determinarse la regulación de la producción de citocinas mediada por el endotelio en el pulmón. Es posible que las células endoteliales puedan regular la producción de citocinas en el pulmón a través de un mecanismo de diafonía complejo con epitelio pulmonar o células hematopoyéticas residentes. Sin embargo, la identificación de las células endoteliales como orquestadores centrales de la inflamación inmune mediada innata temprana es de interés fundamental y tiene amplias implicaciones para el tratamiento de múltiples enfermedades. Se ha informado de la contribución de la producción de citocinas proinflamatorias y quimiocinas aberrantes a la patogénesis para enfermedades virales y bacterianas, incluido el VIH (

), Hantavirus (

), síndrome respiratorio agudo severo (SRAS) (

) y neumonía bacteriana neumocócica (

) Además, la etiología de varias afecciones autoinmunes se ha asociado directamente con respuestas inmunitarias innatas excesivas (

) Por lo tanto, la comprensión de las vías celulares que regulan la tormenta de citoquinas y el desarrollo de herramientas de señalización química apropiadas para identificar puntos de control fisiopatológicos no solo proporcionan información sobre las interacciones microbianas-huésped, sino que también pueden revelar enfoques adicionales para lograr una inmunoterapia efectiva en múltiples enfermedades. Además, nuestros resultados presentan un mecanismo no linfopenico por el cual el tratamiento con análogo de esfingosina suprime las respuestas inmunes patógenas. Por último, estos datos sugieren que S1P endógeno actúa sobre S1P endotelial 1 El receptor podría ser un regulador negativo de la amplificación de citocinas y aumentar la posibilidad de que las heterogeneidades en el metabolismo de S1P entre individuos puedan contribuir a las ventajas o desventajas conferidas por la individualidad genética para la supervivencia del huésped en una serie de enfermedades.

Procedimientos experimentales

 Ratones, virus, compuestos y reactivos

Ratones machos C57Bl / 6 de seis a ocho semanas de edad y ratones S1P 1 -eGFP descritos en otra parte (

) fueron criados y mantenidos en una instalación de cría cerrada en el Instituto de Investigación Scripps. La influenza A / WSN / 33 (WSN; H1N1) y el aislado humano H1N1 2009 A / Wisconsin / WSLH34939 / 09 (un regalo amable de Yoshihiro Kawaoka, Universidad de Madison, WI) se amplificaron y se colocaron en placas en Riñón Canino Madin-Darby (MDCK) ) células. Los ratones se infectaron intratraquealmente (it) con 1 × 10 4 UFP del virus de la gripe A / WSN / 33 o intranasalmente con 1 × 10 5UFP de A / Wisconsin / WSLH34939 / 09 bajo anestesia con isoflurano. A 1 hora después de la infección, los ratones se anestesiaron por inhalación de isoflurano para administrar el vehículo (100 ul de agua), AAL-R (0.2 mg / kg disuelto en agua), CYM-5442 (2 mg / kg disuelto en agua), o RP-002 (3 mg / kg o 6 mg / kg por vía oral disueltos en agua). Se administraron dosis múltiples de compuesto en los tiempos específicos enumerados en las leyendas de figurte. (AAL-R y CYM-5442 se sintetizaron según los métodos publicados (

) RP-002, (R) -2- (4- (5- (3-ciano-4-isopropoxifenil) -l, 2,4-oxadiazol-3-il) -2,3-dihidro-lH-inden-l -ylamino) -N, N-dimethylacetamide hydrochloride, se sintetizó de acuerdo con el método publicado (

) El compuesto tenía una CE 50 para S1P1 de 0,13 nM, era> 100 veces selectivo frente a S1P5, y era 10.000 veces selectivo frente a S1P2, 3 y 4 respectivamente, cuando se analizó como se describe (

) El CCL2 murino recombinante (rmCCL2) se adquirió de Shenandoah Biotechnology Inc. (Warwick, PA).

 Análisis de citoquinas y quimiocinas

La tráquea de ratones sacrificados se expuso, se cortó e incubó con una aguja roma de calibre 18. Se infundió un mililitro de solución salina tamponada con fosfato suplementada con Complete Mini, cóctel inhibidor de proteasa libre de EDTA (Roche) y se recuperó cuatro veces. El fluido de lavado broncoalveolar recuperado se centrifugó a 3000 × g durante 3 minutos a 4 ° C y se almacenó a -80 ° C hasta su uso. El ELISA multiplex se realizó en el sobrenadante por Quansys Biosciences (Logan, UT) para detectar IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL- 10, IL-12p70, TNF-α, MIP-1α, MCP-1, GM-CSF, IFN-γ y RANTES. Los ELISA también se realizaron utilizando CCL2 (MCP-1), CCL5 (RANTES), CXCL10 (IP-10), IL-1α, IL-6, TNF-α e IFN-γ Duoset kits (sistemas de I + D), así como el VeriKineKits de ELISA de interferón alfa e interferón beta de ratón (Pestka Biomedical Laboratories, Inc). Para la cuantificación de la expresión de quimiocinas de ARNm, las células endoteliales de pulmón se purificaron con FACS a> 90% -95% de pureza, y el ARNm se purificó usando el mini kit RNeasy de QIAGEN. Antes de la PCR en tiempo real, el ADN genómico se digirió y se hizo ADNc usando el kit RT 2 First Strand (C-03) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (SA Biosciences, Frederick, MD). Se añadió ADNc (200 ng) a pocillos individuales y se cuantificó usando la matriz de PCR de perfil RT 2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (SA Biosciences, Frederick, MD).

 Análisis celular por citometría de flujo

Los pulmones se cosecharon de ratones perfundidos con PBS y se cortaron mecánicamente en trozos pequeños de tejido usando tijeras quirúrgicas. Los pulmones cortados en cubitos se suspendieron en 4 ml de tampón CDTI (0,5 mg / ml de colagenasa de Clostridium histolyticum tipo IV [Sigma], 0,1 mg / ml de Dnasa I de páncreas bovino grado II [Roche], 1 mg / ml de inhibidor de tripsina tipo Ii-s [Sigma] en DMEM) durante 1 hora a 37 ° C. Luego, el pulmón se interrumpió mecánicamente a través de un filtro de 100 μm, y los glóbulos rojos se lisaron usando tampón de lisis de glóbulos rojos (0.02 Tris-HCL y 0.14 NH 4Cl). Las células inflamatorias se purificaron mediante centrifugación en Percoll tamponado con PBS al 35% (GE Healthcare Life Sciences) a 1.500 rpm durante 15 minutos. Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de tinción y los receptores Fc se bloquearon usando 25 μg / ml de anti-ratón CD16 / 32 (BD Biosciences). Las células se tiñeron con los siguientes anticuerpos anti-ratón: gp38 conjugado con AlexaFluor 488 (eBioscience; clon eBio8.1.1), conjugado con PE (BioLegend, Inc .; clon ME13.3) y conjugado con APC (eBioscience; clon 390) CD31 , EpCAM conjugado con PE-Cy7 (BioLegend, Inc .; clon 68.8), CD45.2 conjugado con azul del Pacífico (BioLegend, Inc .; clon 104), NK1.1 conjugado con PerCP-Cy5.5 (BD Biosciences; clon PK136 ), CD3e conjugado con PE-Cy7 (eBioscience; clon 145-2C11), CD4 conjugado con e450 (eBioscience; clon L3T4), CD8α conjugado con PE (BD Biosciences; clone 53-6.1), B220 conjugado con azul del Pacífico (BD Biosciences; clon RA3-6B2), CD19 conjugado con PE (BD Biosciences, clon 1D3), CD11b conjugado con PE-Cy7 (eBiosciences; clon M1 / ​​70), CD11c conjugado con PerCP-Cy5.5 (eBiosciences; clon N418), Gr-1 conjugado con APC (BD Biosciences; clon RB6-8C5), Ly6G conjugado con azul pacífico y PE (BD Biosciences; clon IA8), F480 conjugado con APC (eBioscience; clon BM8), PE 7/4 conjugado (AbD Serotec; clon 7/4), I / AI / E conjugado con PE (BD Biosciences; clon M5 / 114.15.2), CD205 conjugado con PE-Cy7 (eBiosciences; clon 205yekta), conjugado con Fitc CD69 (BD Biosciences; clon H1.2F3), y CD25 conjugado con APC (eBiosciences; clon PC61.5). La adquisición de citometría de flujo se realizó con un citómetro de flujo BD LSR II impulsado por BD FACSD (Becton, Dickinson and Company). Luego, los datos se analizaron con el software FlowJo (Treestar Inc.). CD19 conjugado con PE (BD Biosciences, clon 1D3), CD11b conjugado con PE-Cy7 (eBiosciences; clon M1 / ​​70), CD11c conjugado con PerCP-Cy5.5 (eBiosciences; clon N418), Gr-1 conjugado con APC (BD Biociencias; clon RB6-8C5), azul Pacífico y Ly6G conjugado con PE (BD Biosciences; clon IA8), F480 conjugado con APC (eBioscience; clon BM8), conjugado con PE 7/4 (AbD Serotec; clon 7/4), I / AI / E conjugado con PE (BD Biosciences; clon M5 / 114.15.2), CD205 conjugado con PE-Cy7 (eBiosciences; clon 205yekta), CD69 conjugado con Fitc (BD Biosciences; clon H1.2F3) y conjugado con APC CD25 (eBiosciences; clon PC61.5). La adquisición de citometría de flujo se realizó con un citómetro de flujo BD LSR II impulsado por BD FACSD (Becton, Dickinson and Company). Luego, los datos se analizaron con el software FlowJo (Treestar Inc.). CD19 conjugado con PE (BD Biosciences, clon 1D3), CD11b conjugado con PE-Cy7 (eBiosciences; clon M1 / ​​70), CD11c conjugado con PerCP-Cy5.5 (eBiosciences; clon N418), Gr-1 conjugado con APC (BD Biociencias; clon RB6-8C5), azul Pacífico y Ly6G conjugado con PE (BD Biosciences; clon IA8), F480 conjugado con APC (eBioscience; clon BM8), conjugado con PE 7/4 (AbD Serotec; clon 7/4), I / AI / E conjugado con PE (BD Biosciences; clon M5 / 114.15.2), CD205 conjugado con PE-Cy7 (eBiosciences; clon 205yekta), CD69 conjugado con Fitc (BD Biosciences; clon H1.2F3) y conjugado con APC CD25 (eBiosciences; clon PC61.5). La adquisición de citometría de flujo se realizó con un citómetro de flujo BD LSR II impulsado por BD FACSD (Becton, Dickinson and Company). Luego, los datos se analizaron con el software FlowJo (Treestar Inc.). clon M1 / ​​70), CD11c conjugado con PerCP-Cy5.5 (eBiosciences; clon N418), Gr-1 conjugado con APC (BD Biosciences; clon RB6-8C5), azul del Pacífico y Ly6G conjugado con PE (BD Biosciences; clon IA8 ), F480 conjugado con APC (eBioscience; clon BM8), 7/4 conjugado con PE (AbD Serotec; clon 7/4), I / AI / E conjugado con PE (BD Biosciences; clon M5 / 114.15.2), PE CD205 conjugado con Cy7 (eBiosciences; clon 205yekta), CD69 conjugado con Fitc (BD Biosciences; clon H1.2F3) y CD25 conjugado con APC (eBiosciences; clon PC61.5). La adquisición de citometría de flujo se realizó con un citómetro de flujo BD LSR II impulsado por BD FACSD (Becton, Dickinson and Company). Luego, los datos se analizaron con el software FlowJo (Treestar Inc.). clon M1 / ​​70), CD11c conjugado con PerCP-Cy5.5 (eBiosciences; clon N418), Gr-1 conjugado con APC (BD Biosciences; clon RB6-8C5), azul del Pacífico y Ly6G conjugado con PE (BD Biosciences; clon IA8 ), F480 conjugado con APC (eBioscience; clon BM8), 7/4 conjugado con PE (AbD Serotec; clon 7/4), I / AI / E conjugado con PE (BD Biosciences; clon M5 / 114.15.2), PE CD205 conjugado con Cy7 (eBiosciences; clon 205yekta), CD69 conjugado con Fitc (BD Biosciences; clon H1.2F3) y CD25 conjugado con APC (eBiosciences; clon PC61.5). La adquisición de citometría de flujo se realizó con un citómetro de flujo BD LSR II impulsado por BD FACSD (Becton, Dickinson and Company). Luego, los datos se analizaron con el software FlowJo (Treestar Inc.). clon IA8), F480 conjugado con APC (eBioscience; clon BM8), 7/4 conjugado con PE (AbD Serotec; clon 7/4), I / AI / E conjugado con PE (BD Biosciences; clon M5 / 114.15.2) , CD205 conjugado con PE-Cy7 (eBiosciences; clon 205yekta), CD69 conjugado con Fitc (BD Biosciences; clon H1.2F3) y CD25 conjugado con APC (eBiosciences; clon PC61.5). La adquisición de citometría de flujo se realizó con un citómetro de flujo BD LSR II impulsado por BD FACSD (Becton, Dickinson and Company). Luego, los datos se analizaron con el software FlowJo (Treestar Inc.). clon IA8), F480 conjugado con APC (eBioscience; clon BM8), 7/4 conjugado con PE (AbD Serotec; clon 7/4), I / AI / E conjugado con PE (BD Biosciences; clon M5 / 114.15.2) , CD205 conjugado con PE-Cy7 (eBiosciences; clon 205yekta), CD69 conjugado con Fitc (BD Biosciences; clon H1.2F3) y CD25 conjugado con APC (eBiosciences; clon PC61.5). La adquisición de citometría de flujo se realizó con un citómetro de flujo BD LSR II impulsado por BD FACSD (Becton, Dickinson and Company). Luego, los datos se analizaron con el software FlowJo (Treestar Inc.). La adquisición de citometría de flujo se realizó con un citómetro de flujo BD LSR II impulsado por BD FACSD (Becton, Dickinson and Company). Luego, los datos se analizaron con el software FlowJo (Treestar Inc.). La adquisición de citometría de flujo se realizó con un citómetro de flujo BD LSR II impulsado por BD FACSD (Becton, Dickinson and Company). Luego, los datos se analizaron con el software FlowJo (Treestar Inc.).

 Western Blot

Las poblaciones de células pulmonares purificadas por FACS (1 x 10 5 células) usando los anticuerpos descritos anteriormente se homogeneizaron en tampón RIPA suplementado con inhibidores de proteasa (Pierce). Los lisados ​​se centrifugaron a 50,000 × g durante 30 minutos, y la concentración de proteína en el sobrenadante se determinó por ensayo BCA (Pierce). Se cargaron cantidades iguales de proteína de los lisados ​​celulares en condiciones no desnaturalizantes y se separaron mediante SDS-PAGE en geles Bis-Tris NuPAGE (Novex) al 4% -12%. Los geles se transfirieron a membranas de PVDF seguido de sondeo para GFP usando un anticuerpo anti-GFP (Abcam) y un secundario HRP de cadena ligera de Ig anti-conejo (ELC Biosciences) usando autoradiografía de quimioluminiscencia.

Expresiones de gratitud

Esta es la publicación número 21112 del Departamento de Inmunología y Ciencia Microbiana y el Departamento de Fisiología Química y el Centro de Detección Molecular del Instituto de Investigación Scripps, el Instituto de Investigación Scripps (TSRI). Este trabajo fue apoyado, en parte, por las subvenciones de USPHS AI074564 (MBAO, HR, KBW y JRT), AI009484 (MBAO), AI05509 (HR), MH084512 (HR) y las subvenciones de capacitación de NIH NS041219 (KBW), AI007244 (KBW ) y AI007364 (JRT). Agradecemos a Marcus Boehm, Li-ming Huang y Bryan Clemons (Receptos, Inc.) por ayudarnos a proporcionar RP-002 como herramienta química. Hugh Rosen es uno de los fundadores de Receptos. Edward Roberts es consultor de Receptos. Fiona Scott, Esther Martinborough y Robert Peach son empleados de Receptos.

Información suplementaria

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Cifras

  • Figura miniatura fx1
    Gráficamente abstracto
  • Figura miniatura gr1
    Figura 1 El agonismo del receptor S1P 1 suprime la producción temprana de citocinas y quimiocinas proinflamatorias y el reclutamiento de células inmunes innatas durante la infección por el virus de la influenza
  • Figura miniatura figs1
    Figura S1 S1P 1 El agonismo suprimió múltiples citocinas / quimiocinas proinflamatorias después de la infección por el virus de la influenza, relacionadas con las  ,  ,  y 
  • Figura miniatura figs2
    Figura S2 El tratamiento con AAL-R o CYM-5442 no alteró los títulos virales en el pulmón después de la infección por el virus de la influenza, relacionado con la 
  • Figura miniatura gr2
    Figura 2 El agonismo del receptor S1P 1 suprime la producción y el reclutamiento temprano de citocinas y quimiocinas proinflamatorias y el reclutamiento de células inmunes innatas activadas durante la infección por el virus de la influenza porcina H1N1: 2009 patógena humana
  • Figura miniatura figs3
    Figura S3 El tratamiento RP-002 no altera los títulos virales en el pulmón después de la infección por el virus de la influenza patógena humana, en relación con la  y la 
  • Figura miniatura gr3
    Figura 3 La administración oral de un agonista S1P 1 suprime la producción temprana de citocinas y quimiocinas innatas y mejora significativamente la supervivencia a la infección letal con el virus de la influenza porcina H1N1 2009
  • Figura miniatura gr4
    Figura 4 El receptor S1P 1 se expresa en endotelio pulmonar y linfocitos, pero no en células epiteliales pulmonares
  • Figura miniatura figs4
    Figura S4 El receptor S1P 1 se expresa en linfocitos pulmonares y células endoteliales, relacionado con la 
  • Figura miniatura gr5
    Figura 5 El agonismo del receptor S1P 1 suprime las respuestas inmunitarias proinflamatorias tempranas independientemente de los linfocitos
  • Figura miniatura figs5
    Figura S5 El agonismo S1P 1 suprime la activación inmune innata de células después de la infección por influenza en ratones con deficiencia de linfocitos, en relación con la 
  • Figura miniatura gr6
    Figura 6 El agonismo del receptor S1P 1 suprime activamente el reclutamiento de células inmunes innatas a través de la regulación negativa de la expresión de quimiocinas en las células endoteliales pulmonares
  • Figura miniatura figs6
    Figura S6 El agonismo S1P 1 no altera los niveles de expresión de la molécula de adhesión en las células endoteliales pulmonares, en relación con la 
  • Figura miniatura figs7
    Figura S7 La inhibición de macrófagos inflamatorios / reclutamiento de monocitos no altera las respuestas de citocinas / quimiocinas después de la infección por el virus de la influenza, en relación con la 
  • Figura miniatura gr7
    Figura 7 Las respuestas de citocinas proinflamatorias son independientes del reclutamiento de células inmunes innatas y dependen de la señalización de interferón tipo I